原代細胞轉染的實驗操作要注意的事項

　　原代細胞（primaryculturecell）是指從機體取出后立即培養的細胞。有人把培養的第1代細胞與傳10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫學基礎研究，如蛋白質組學、基因組學、細胞株（系）研究、DNA，RNA和遺傳學研究等，還可應用于當今熱門的生物醫藥產業如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。

　　細胞轉染是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

　　原代細胞細胞轉染的實驗操作要注意的事項：

　　1.轉染試劑的準備

　?、賹?00ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

　?、谡鹗幒髮⒃噭┓旁冢?0攝氏度保存，使用前還需震蕩。

　　2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

　　3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。

　　4.吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

　　5.加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

　　6.到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養基繼續培養24－48小時。

　　三、第二次細胞傳代

　　1.在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

　　2.再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新轉入培養皿中。

　　3.在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。